То, что происходит на экране с тиграми, на самом деле случилось с белыми медведями. В основу сценария лёг рассказ моряка и писателя Виктора Конецкого о путешествии на остров Врангеля. Оттуда на пароходе везли трёх белых медведей, но во время рейса один из них внезапно вырвался из клетки. К счастью, его удалось быстро загнать обратно с помощью пожарного шланга. А у писателя появился необычный сюжет для рассказа.
Буфетчицу Марианну в картине сыграла сама Маргарита Назарова. Роль в «Полосатом рейсе» — единственная полноценная работа дрессировщицы в кино. До этого она дублировала актрис в фильмах «Случай в тайге», «Укротительница тигров» и «Тигроловы».
Режиссёр приложил немало усилий, чтобы уговорить Евгения Леонова сняться в картине — знаменитый актёр, как и его герой Шулейкин, до смерти боялся полосатых хищников. В эпизоде в ванной между тигром и Леоновым должно было стоять закалённое стекло, но во время съёмок его незаметно убрали. Намыленный актёр ничего не заподозрил и об опасности узнал уже после съёмок.
В фильме снимались сразу десять цирковых тигров, среди которых был и любимец Маргариты Назаровой по кличке Пурш. Льва Ваську специально для съёмок купили в Херсонском зоопарке, а шимпанзе Пирата отыскали в Киевском зоопарке вместе с его супругой Чилитой — порознь обезьянки становились неуправляемыми, поэтому на площадку пришлось пригласить обоих. Актёр Иван Дмитриев за время съёмок очень сдружился с Пиратом — впоследствии он не раз навещал своего кинопартнёра в зоопарке.
